تولید مثل در خزندگان (سوسماران)

 

 

 

 

چکیده ای از فصل چهارم پایان نامه کارشناسی ارشد

فرهنگ ترکی

دانشگاه رازی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

 

 

(2 واحد از 8 واحد پایان نامه)

 

 

 

 

استاد راهنمای این قسمت

جناب آقای دکتر امینی

(دانشیار، آناتومیست و هیستولوژیست گروه زیست دانشگاه رازی)

 

 

با مشاوره و چک نهایی توسط

جناب آقای دکتر قربانی

(دانشیار، هیستولوژیست دانشکده علوم پزشکی کرمانشاه)

 

 

استفاده از مطالب این قسمت از پایان نامه با رفر نمودن  مجاز میباشد

(تصاویربرداشته شده اند و رفرنس نیز به دلیل استفاده های غیر مجاز درج نشده است

در صورت استفاده لطفا با امیل من مکاتبه نمایید)

farhang_torki@yahoo.com

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل چهارم

 

اسپرماتوژنز در Ophisops elegans و مقدمه ای بر تولید مثل سوسماران زاگرس مرکزی

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4-1: مقدمه و کلیات  Introduction & General Consepts

 

خزندگان در ميان آمنيون‌داران بخاطر نمايش هر دو روشهاي تخمگذاري و زنده‌زايي توليد مثل مورد توجه و با ارزش هستند . آنها همچنين چرخه‌هاي توليد مثلي دارند كه ممكن است فصلي يا مداوم باشند  .اگر چه وضعيت دو جنسي (bisexual) غالب است اما تعدادي از سوسمارها پارتنوژنز توصيف شده‌اند . عليرغم مطالعات فراوان بروي چرخه هاي توليد مثل مارها و سوسمارها، طبيعت فاكتورهاي داخلي و خارجي كه بر كنترل فعاليت ترشحي گنادها ي خزندگان اثر متقابل دارند بخوبي شناخته نشده است(حيدري 85).  .

از لحاظ وضعيت دستگاه‌ هاي توليد مثل در بيشتر خزندگان، بيضه‌ها نزديك به ستون مهره ها قرار مي‌گيرند، بيضه چپ نسبت به بيضه راست اندكي پايين‌تر قرار گرفته است . لوله‌هاي اسپرم‌ساز و سلولهاي بينابيني معمولاً همراه هم در طي فصل توليد مثل هيپرتروفي حاصل مي‌كنند و ترشح آندروژني افزايش مي يابد. به نظر مي‌رسد كه حجم بيضه‌ها بطور مستقيم با وضعيت زادو ولد مربوط باشد. تخمدانها در بيشتر گونه‌هاي سوسمار داراي تقارن دو طرفي هستند و چرخه تخمداني بطور تيپيك شامل اووژنز، ويتلوژنز، اوولاسيون (تخمك گذاري) و تشكيل كورپوس لوتيوم یا جسم زرد است و بسته به روش توليد مثل پوسته تشكيل (تخمك گذاري) و يا نگهداري تخم با تشكيل يك جفت انجام مي‌شود(حيدري 85).  .

 

4-1-1: سيستم جفت گيري

اکثر خزندگان نر و ماده ژنیتالیای خارجی ندارند اما آنها دارای ارگانهای تولید مثلی متفاوتی هستند که در زیر مختصراً در مورد آنها توضیح می دهیم

سيستم جفت گيري نر سوسمارها (شکل 4-1-1) از يك جفت بيضه سفيد رنگ و بيضوي شكل ، يك جفت اسپرميداكت و يك جفت همي پنيس تشکیل شده است. همی پنیس در مارها و سوسمارها که بعنوان دو تا برآمدگی در عقب کلوآک در قاعده دم دیده می شوند. کروکودیلها ، Turtles وTortoises یک پنیس در عقب کلواک دارند. .پنیس یا همی پنیس ها به مجاری ادراری متصل نیستند و اصولاً یک ارگان تولید مثلی می باشند و در تاكسون هاي مختلف متنوع مي باشد (شکل 4-1-1) . بر اساس مشاهدات صورت گرفته در طبيعت در هنگام جفت گيري يكي از دو همي پنيس عمل آميزش را انجام می دهد (حیدری 1385).

هر بیضه از طریق یک چین صفاقی بنام مزوركيوم (Mesorchium) به دیواره بدن وصل می شود . اندازه هر بيضه با توجه به اندازه تاكسون و فصل نمونه گيري متفاوت مي باشد . در سوسماران بدون دست و پا و برخي مارها يك بيضه حالت قدامي و ديگري حالت خلفي دارد، در برخي مارها و سوسمارها  بيضه ها در داخل كيسه اي حاوي لنف قرار می گیرد . در لاكپشت های، crocs و tuatara ها گنادها حالت سفتي دارند.

 

سيستم جفت گيري ماده سوسمارها متشكل از يك جفت تخمدان، يك جفت اويداكت مي باشد (حیدری 1385) (شکل 4-1-2). اویداکت اعمال زیادی را انجام می دهد که از جمله می توان به تولید آلبومین، پوسته تخم، ذخیره اسپرم، رسوب پوسته تخم، حفظ جنین اولیه، تخمگذاري یا جنین و کمک به جفت برای تبادل گاز و مواد غذایی برای جنین اشاره کرد.

 

علاوه بر اینکه از روی سیستم های جنسی می توانیم جنس نر وماده را تشخیص بدهیم خصوصیات جنسی ثانویه ای نیز وجود دارند که می توانند به این تشخیص کمک کنند . در اکثر لاک پشت های نر (Tortoises و Turtles) سپر شکمی مقعر و دم بطور نسبی درازتر است .

اکثر نرهای ایگوانیده و جکونیده دارای منافذ رانی و پیش مخرجی هستند که یک ماده مومی ترشح می کنند که این ترشح در نرها بیشتر از ماده ها می باشد .

اکثر مارهای بوآ و پیتون دارای سیخکهایی هستند که در هر طرف مخرج قرار گرفته و در اگثر نرها این سیخکها بزرگتر است .

 با استفاده از اندازه قطر كلواك مي توان جنس نر و ماده را تشخيص داد، جنس نر به دليل خارج شدن همي پنيس از كلواك عرض بيشتري دارند. براي مثال در Anolis carolinensis  اين مورد نشان داده شده است (شکل 4-1-3) .

 

                 

4-1-2: تنوع توليد مثلي در سوسماران

به طور کلی سوسماران داراي سه نوع مد توليد مثل به شرح زير مي باشند :

1- تخم گذار (Oviparous)

بيشتر سوسمار‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي بيابان تخمگذار هستند (شکل 4-1-4) اما برخي جنسها از قبيل ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌Mabuya شامل هر دو گونه‌هاي تخمگذار و تخمگذار زنده‌زا مي‌باشند. برخي گونه‌ها از قبيل Uromastix و Ocantuurus  يكبار در سال تخمگذاري مي‌كنند در حاليكه برخي ديگر ممكن است پنج بار در سال تخمگذاري داشته باشند . ماده‌هاي Terasolepis fasiata و Terasclepis fasiata بيش از 12 بار در سال (با فواصل تقريباً 14 روز بين تخمگذاريها) تخمگذاري مي‌كنند. ماده ها برای تخم گذاشتن نیازی به حضور نر ندارند . هنگامي كه يك تخم از تخمدان آزاد مي‌شود آن الزاماً وارد اويداكت همان طرف بدن نمي‌شود . بطور آشكار، نسبتاً معمول است كه تخمها بعد از آزاد شدن از تخمدان، تغيير سمت (جهت) مي‌دهند. اين وضعيت در بسياري از گونه‌ها ديده شده است. بيشتر گونه‌ها تخم‌هايشان را در زمين حفر مي‌كنند و يا در زير صخره‌ها قرار مي‌دهند. برخي گونه‌ها مثل ماده‌هاي Holbrookia texana همه تخمهايشان را يك مرتبه در يك محل نمي‌گذارند، بلكه آنها را بطور وسيعي پخش مي‌كنند، برخي از جكوها تخمهايشان را بوسيله يك ماده چسبناك به صخره‌ها مي‌چسبانند. پوسته هاي آهكي تخم برخي از جكوها به نظر مي رسد كه تحت تأثير رطوبت قرار مي‌گيرد. شكفتن تخم با بارندگي در طي فصل انكوباسيون نسبت عكس دارد(حيدري 85).

تعداد تخمهاي گذاشته شده در هر بار تخمگذاري در سوسمارهاي بياباني هميشه يكسان نيستند. اختلافات مشاهده شده ممكن است نتيجه‌اي از سن سوسمار يا تغييرات فصلي در تعداد تخم در گونه هايي باشد كه بيش از يك بار تخمگذاري در سال دارند. از سوي ديگر گونه ممكن است، از سالي به سال ديگر، تغييرات در تعداد تخم نشان دهد، كه بدليل شرايط محيطي متفاوت مي‌باشد. اين مي‌تواند همچنين اختلافات واقعي را در جمعيت‌هاي متفاوت يك گونه منعكس كند (نشان بدهد). تخمها بايستي آب را بطور مستقيم براي انكوباسيون موفق دريافت نمايند . رطوبت نسبتاً بالا خودش شكفتن موفق تخم را اجازه نمي‌دهد. يكي از علل اصلي تغييرپذير ي در فراواني، به نظر مي‌رسد كه موفقيت توليد مثل باشد. كه بطور وسيعي بوسيله تغييرپذيري فصلي رطوبت براي تخمها تحت تأثير واقع مي‌شود. اهميت رطوبت آزاد لازم است، بدليل اينكه تخمهاي سوسمارها مقداري از آب اطرافشان را مي‌گيرند و بطور قابل ملاحظه‌اي وزن و اندازه آنها در طي انكوباسيون افزايش مي‌يابد. تغيير در طول دوره انكوباسيون يك گونه توسط محققين اشاره شده است كه احتمالاً نتيجه‌اي از وضعيت‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي متفاوتي است كه تخمها انكوبه مي‌شوند. گرما نيز براي نمو جنينهاي مهره‌داران ضروري است و سرعت نمو تا حدي بوسيله گرماي در دسترس تعين مي‌شود.

 

 

 2- تخم گذار زنده زا (Ovoviviparous)

این نوع تولید مثل در سوسمار های Lacerta vivipara (از خانواده لاسرتیده)، Lerista bougainvillii و Saiphos equalis (از خانواده سینسیده)  و سوسمار سمی مکزیکی دیده می شودو تخمها در اويداكت تا زماني قبل از خروج نوزادان ، نگهداري مي شوند. ماده های حامله و باردار قبل از گذاشتن تخم هایشان به مدت 3 الی 6 هفته غذا نمی خورند چون شکم از تخم های که در داخل اویداکت قرار گرفته پر شده و به همین دلیل معده کاملاً بهم فشرده و یک فضای کوچک برای غذا خوردن در معده وجود دارد(حيدري 85).

 3- زنده زا (Viviparous)

انتقال تکاملی از تخم گذار بودن به حالت زنده زایی در خزندگان پولک دار رخ داده است اما تعداد زیادی از خزندگان در اصل زنده زا بوده اند. برخي از تاكسون هاي خـانواده جـكونيده ، Mabuya aurata ،Phrynosoma braconnieri و  Sceloporus bicanthalisزنده‌ زا مي باشند. اين جانوران داراي يك ساختمان جفت مانند (رابط بين مادر و جنين) مي‌باشند و نوزاد تا زمان تكوين كامل در بدن والد ماده باقي مي ماند و زماني كه تكوين به پايان رسيد به صورت يك نوزاد كامل از بدن والد خارج مي‌گردد.

4- پارتنوژنز (Partenogenesis)

سوسمار ها دارای تولید مثل جنسی و غیر جنسی هستند . یک شکلی از تولید مثل غیر جنسی بکرزایی است که تخمک بدون لقاح با اسپرم تبدیل به یک فرد جدید می شود. بطور معمول این روش در بعضی از گیاهان پست(Agamospemy)، بی مهره گان مثل روتیفرا، شته ها ، زنبورهای عسل و بعضی از مهره داران (سوسمارها، سمندرها، بعضی ماهی ها و حتی بعضی بوقلمون ها) دیده می شود. افراد ناشی از بکرزایی همگی ماده می باشند. مهمترین گروه از سوسمار ها که بوسیله بکر زایی تولید مثل می کنند به جنس Cnemidophoros و Lacerta متعلق می باشند. حدود 50 گونه از Whiptail(شلاق دمی ها) منحصراً توسط بکرزایی تولید مثل می کنند. این سوسمارها در آب و هوای خشک و گاهی اوقات آب و هوای خشن جنوب غربی ایالات متحده و شمال مکزیک زندگی می کنند. همه این گونه ها با تولید مثل غیر جنسی بنظر می رسد که از طریق هیبریداسیون 2 یا 3 گونه با تولید مثل جنسی که منجر به افراد پلی پلوئیدی می شود ناشی شده باشند. مکانیسم هایی که بوسیله آن ترکیب کروموزوم از 2 یا 3 گونه می تواند منجر به تولید مثل بکرزایی شود نا مشخص است. یک جنبه جالب تولید مثل در این سوسمارهای دم شلاقی این است که رفتارهای جفت گیری هنوز با وجود اینکه جمعیت ها همه بطور کامل ماده هستند دیده می شود. یک جنس ماده در این حالت نقش جنس نر را بازی می کند و سوار ماده های دیگر می شود. دلیل این عمل هم به چرخه های هورمونی آنها برمی گردد که باعث می شود بعضی از سوسمار ها وقتی که  سطح استروژن آنها پایین است نقش جنس نر و بعضی ها که سطح استروژن آنها بالاست نقش جنس ماده را بازی می کنند. این مارمولک ها برای ماکسیمم موفقیت تولید مثلی به یک محرک جنسی نیاز دارند. بيشتر گونه ها به نظر مي‌رسد كه تريپلوئيد (Triploids) باشند. اما برخي از گونه‌ها ديپلوئيد هستند (حيدري 85).

بر اساس مطالعات فيلوژنتيكي روي مد هاي توليد مثلي، مد توليد مثلي زنده زايي به عنوان مد توليد مثلي مونوفيليتيك درآمده است ( شكل 4-1-5) كه نشان دهنده جدا بودن تاكسون هاي زنده زا، از نظر فيلوژنتيكي نسبت به تخم گذارها مي باشد در مطالعات فيلوژنتيكي تاكسون هاي سوسمار تخم گذار گروه مونوفيلتيك را ندارند و در درخت فيلوژنتيكي به دو گروه مونوفيلتيك تحت عنوان Long incubation oviparity  و Short incubation oviparity  مي توان طبقه بندي نمود (Smith  et al 2001) .

 

 

4-1-3: تیپ های تولید مثلی

سوسماران به طور كلي سه تيپ توليد مثلي را نشان می دهند (Pough et al., 1998): ممتد، Associated و Dissociated . در زیر به بررسی هر کدام از آنها میپردازیم:

(1)  تيپ توليد مثلي ممتد                        Contineous Type

 تولید مثل در این تیپ در طول سال اتفاق افتاده، یعنی فعالیت جنسی در دو جنس نر و ماده در طول سال وجود دارد و میتوانند جفت گیری را انجام دهند. در این تیپ تولید مثلی، جنس ماده در طول سال تخم گذاری را انجام داده. میتوان در بررسی جمعیتی نمونه های جوان تازه از تخم درآمده را در طول سال مشاهده نمود. این تیپ تولید مثلی در نواحی تروپیکال اتفاق افتاده (Sherbrooke, 1975; Somma and Brooks, 1976; Jenssen and Nunez, 1994).  چرا که در این نواحی شرایط محیطی مسائدی برای تولید مثل ممتد وجود دارد.

(2)  تيپ توليد مثلي Dissociated

فعالیت جنسی در نرها و ماده ها هر دو محدود به زمان خاصی از سال میباشد اما این محدودیت برای جنس نر بیشتر میباشد. زمانی که سیستم جنسی نر فعال است آمیزش جنسی را با جنس ماده انجام داده، اما لقاح صورت نمیگیرد و اسپرم در درون سیستم جنسی ماده ذخیره میگردد (شکل 4-1-6). دلیل این امر مساعد نبودن شرایط محیطی برای لقاح و تولید نسل میباشد. زمانی که شرایط محیطی مساعد شد لقاح در درون سیستم جنسی جنس ماده صورت گرفته. در این فاصله زمانی (آمیزش تا لقاح) اسپرمها در سیستم جنسی جنس ماده ذخیره میگردد. اين تيپ اسپرماتوژنز بيشتر در نواحيي اتفاق مي افتد كه به طور ناگهاني شرايط كليمايي به هم ميخورد و داراي فصول باراني و خشك ميباشند، مانند نواحي نئوتروپيك يا برخي نواحي معتدل گرم (Guillette and Sullivan, 1985; Méndez de la Cruz et al., 1988; Van Wyk, 1995)

 

 

(3)  تيپ توليد مثلي Associated

فعالیت جنسی در دو جنس نر و ماده در محدوده زمانی خاصی از سال اتفاق می افتد. در این تیپ، آمیزش جنسی و لقاح در یک زمان صورت گرفته، یا به بیانی دیگر بین آمیزش و لقاح همزمانی وجود دارد، اين تيپ اسپرماتوژنز بيشتر در نواحي كليمايي معتدل و بخصوص سرد رخ داده (Diaz et al., 1994; Censky, 1995; Huang, 1997).

 

4-1-4: طبقه بندی اسپرماتوژنز

با توجه به فعالیت اسپرماتوژنز در طول سال میتوان اسپرماتوزنز را به دو دسته فصلی و غیر فصلی تقسیم نمود. در زیر به شرح هر کدام از آنها میپردازیم:

4-1-4-1: اسپرماتوژنز غیر فصلی

در این تیپ جنس نر در طول سال فعالیت جنسی را از خود نشان میدهد و اسپرماتوژنز در طول سال صورت میگیرد. یعنی در طول سال جنس نر اسپرم تولید میکند (شکل4-1-7) . برای مثال مطالعات صورت گرفته روی اسپرماتوژنز در گونه Sceloporus bicanthalis در مکزیک نشان داد که این گونه در تمام سال تولید اسپرم را انجام داده (Hernandez-Gallegos et al, 2002).

 

 

4-1-4-2: اسپرماتوژنز فصلی

در این تیپ اسپرماتوزنز در طول سال به طور یکنواخت صورت نمیگیرد و محدود به زمانی از سال میگردد. یعنی در برخی ماه های سال جنس نر میتواند تولید اسپرم کند اما در بقیه ماه ها تولید اسپرم صورت نمیگیرد. دوره اسپرماتوژنز فصلی را میتوان در دو تيپ اسپرماتوژنز Associated و Dissociated  مشاهده نمود. اسپرماتوژنز فصلی در طول سال به دو دوره رژنراسیون و دژنراسیون تقسیم میشود(Wilhoft and Reiter, 1965; Fitch, 1970; Marion and Sexton, 1971; Lofts 1987; Castilla and Bauwens, 1990)  .

الف) دوره رژنراسيون: طي اين دوره اسپرماتوژنز احياء ميگردد، این دوره در نواحي معتدله اين دوره در پاییز و زمستان رخ داده.

ب) دوره دژنراسيون: طي اين دوره اسپرماتوژنز رو به كاهش مينهد. این دوره در نواحی معتدله در طی بهار و تابستان صورت میگیرد.

بررسيهاي اسپرماتوژنز روي تاكسون هايي غير خزنده همچون پستانداران در غرب فلات ايران انجام شده (Sharifi et al 2004a, b). مطالعه اسپرماتوژنز در مورد خزندگان اکثرا محدود به نویسنده میباشد (e.g., Torki 2005a, 2006). اما در این بین مطالعاتی توسط خانم حیدری روی دو گونه از جنس Laudakia در زاگرس مرکزی انجام شده است (حیدری 1385). مطالعه حاضر ادامه مطالعه نویسنده روی تولید مثل و به خصوص اسپرماتوژنز در گونه Ophisops elegans در زاگرس مرکزی میباش.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4-2: مواد و روش كار            Matherial and Methods

 

4-2-1: مطالعه كليمايي

رشته کوه زاگرس ادامه فلات آناتولی می باشد و در فلات غربی ایران واقع شده و از شمال غربی تا جنوب ایران این رشته کوه ادامه دارد . این رشته کوه به سه ناحیه زاگرس شمالی، زاگرس مرکزی و زاگرس جنوبی تقسیم شده است (قبادیان, 1369). استان لرستان در زاگرس مرکزی قرار داشته و ناحیه مطالعاتی در شمال استان لرستان با موقعیت جغرافیايی  º´ Nو º´E واقع شده است. این ناحیه در حاشیه غربی زاگرس مرکزی قرار گرفته و از نظر کلیمایی دارای آب و هوای سرد کوهستانی می باشد (شکل 4-2-1). ارتفاعات ناحیه مطالعاتی بالای 1900 متر می باشد.

 

ناحیه مطالعاتی زمستانی سرد و تابستان ملایمی دارد . بارندگی ها در این ناحیه از اوایل پاییز شروع شده و تا اواسط بهار به طور پراکنده ادامه پیدا می کند (شکل 4-2-2). به دلیل بالا بودن ارتفاع، رطوبت در طول سال وجود دارد مگر در مدت زمان کوتاهي در اواسط مرداد ماه. معمولاً شروع فصل سرد در این ناحیه از نیمه دوم آذر ماه با بارش برف آغاز شده و تا پایان اسفند ماه ادامه دارد.

 

 

4-2-2: مطالعه سوسمار

تاكسون هاي زمستان خواب بسته به تحمل فاكتورهاي اگزوژن (حرارت، تغذيه و .. ) و اندوژن (شرايط فيزيولوژيكي بدن) مدت زمان متفاوتي را در خواب زمستاني به سر ميبرند (Licht 1972; Gregory 1982; Ultsch 1989). تاكسون مورد مطالعه حدود پنج ماه از سال، از اوایل پاییز تا اواخر زمستان را در خواب زمستاني بسر ميبرد و از نظر بيولوژي رفتاري در حالت رکود ميباشد. اما در بقيه سال فعاليت زيستي را از خود نشان داده و از نظر بيولوژي رفتاري فعال ميباشد.

براي بررسي تولید مثل و به خصوص اسپرماتوژنز، گونه Ophisops elegans را از خانواده Lacertidae در نظر گرفته. چرا كه اين تاكسون در زاگرس پراكندگي بالایی دارد و در زيستگاه های متنوعی از جمله نواحی جنگلی، کوهستانی فاقد جنگل و دشتی زیست میکنند (Anderson 1995, Torki 2005b).  توضیحات بیشتر در مورد این سوسمار در فصل تاکسونومیک آورده شده است و میتوان به این بخش رجوع کرد.

 

4-2-3:نمونه گیری

براي شروع مطالعه و وارد شدن به محيط زيست سوسمارها كه اغلب نقاط کوهستانی است بايد تجهيزات كافي به همراه داشت اين تجهيزات شامل دستكش،ظروف نمونه گيري مناسب، وسايل تشريح، كوله پشتي، وسايل جمع آوري و به دام اندازي سوسمارها (در اينجا تفنگ بادي و چوبهاي باريك و دراز)، كمكهاي اوليه، قمقمه ي آب، دوربين عكاسي و ذره بين می باشد .

براي جمع آوري نمونه ها راههاي مختلفي وجود دارد از جمله:

اول : زدن نمونه ها با تفنگ بادي .

دوم : گرفتن نمونه ها بطور مستقيم با دست .

سوم : زدن نمونه ها با چوبهاي نرم و باريك، به طوري كه آسيب زيادي به نمونه ها وارد نشود .

در این مطالعه از روش دوم و سوم استفاده نموده.

مسئله مهم در امر جمع آوري نمونه ها توجه به مكان و زمان جمع آوري است بدين معني كه شخص جمع آوري كننده بايد حتي الامكان از بوم شناسي و زيستگاه گونه هاي مورد مطالعه اطلاعاتي داشته باشد، زيرا هرگونه در محل خاص زندگي كرده و در شرايط ويژه اي ديده مي شود. گونه مورد مطالعه در کوهپایه ها به طور فراوانی دیده میشوند. جهت نگهداري نمونه هاي زنده تا انتقال آنها به آزمايشگاه جهت كارهاي مورفومتريك و خارج كردن دستگاه تناسلي، از كيسه هاي پارچه اي نازك و منفذ دار استفاده گرديد . براي نگهداري نمونه هاي جمع آوري شده ازظروف پلاستيكي و شيشه اي در اندازه هاي مختلف و از فرمالين به عنوان محلول ثابت كننده استفاده گردید، بدين صورت كه فرمالدئيد تجارتي (با غلظت 37 درصد) را 9 تا10 برابر رقيق كرده تا غلظت آن به 3 تا4 درصد برسد. قبل ازهر تماسی با فرمالين، بيضه ها را از نمونه ها که با تزریق الکل به بدن آنها بیهوش شده اند جدا و آنها را جداگانه در فرمالدئيد 4% قرار داديم . برای حصول اطمینان از تثبیت کامل بافتهای داخلی بدن، بوسيله سرنگ مقداري فرمالين به قسمتهاي مختلف بدن تزريق گردید سپس نمونه ها را در يك تشتك پلاستيكي كه قبلاً در كف آن چندين لايه دستمال كاغذي آغشته به فرمالين قرار داده شده مي گذاريم (تا رطوبت فرمالين روي بدن نمونه بماند) . سپس بدن جانور را طوري كه مطالعه ي آن آسان باشد (مثلاً باز كردن انگشتان) حالت مي دهيم . در مرحله بعد دو يا سه لايه دستمال كاغذي روي جانور انداخته و مجدداً با سرنگ روي آنها فرمالين مي ريزيم و نهايتاً درب تشتك را مي بنديم. بعد از حداقل بيست و چهار ساعت نمونه ها را به ظرفهاي پلاستيكي يا شيشه اي حاوي فرمالين 4-3 درصد انتقال مي دهيم . براي اين بررسي نمونه هاي بالغ نر را انتخاب نموده. به این صورت که هر ماه يك بار نمونه برداري را از جنس نر انجام داده و تعدادي نمونه را جمع آوري و تشريح نموده سپس بيضه ها را جدا نموده. در ضمن اندازه پوزه تا مخرج یا SVL را در هر نمونه به طور جداگانه اندازه گیری نموده.

برای مطالعه تولید مثل در این گونه  تعداد 75 نمونه نر و 25 نمونه ماده را گرفته و سیستم جنسی آنها را برای مطاعلات مورفومتریک و بافت شناسی مورد بررسی قرار داده.

برای بررسیهای میکروسکوپی از دستگاه تناسلی نر بصورتی که در زیر می آید مقاطع بافتی تهیه گردید و مقاطع برای اندازه گیری صفات مد نظر مورد استفاده قرار گرفت .

 

4-2-4: روش های بافت شناسی

مراحل پاساژ بافتي(Tisue processing)

بعد از مرحله ثابت كردن نمونه ها به وسيله فرمالين 10% انجام گرفت مرحله پاساژ بافتي يا گردش بافت مي باشد كه در اين مطالعه مراحل پاساژ بافتي به روش دستي انجام گردید .اين روش شامل مراحل زير است :

1- آب گيري (Dehydration) : در اين عمل بايد با مواد جاذب آب، آب اضافی بافت را كه در مرحله ثابت نمودن به جاي مانده است گرفت.  برای این کار نمونه ها به ترتيب در داخل الکل اتیلیک 50% ، 70% ، 80% ، 96% ، 96% ، 100% ، 100% قرار داده شدند و مدت استقرار نمونه ها در هر مرحله الكل دو ساعت بود.

2- شفاف سازي ( Clearing): از آنجا كه براي مطالعات بافتي بايد ضريب انكسارنوري بافت ها يكسان  باشد لازم است آنها شفاف شوند.  براي اينكار بافت ها يك تا دو ساعت در گزيلول قرار داده شدند.  پس از آن مجددا" همين عمل با گزيلول تازه تكرار شد.

3- آغشته سازي ( Impregnation ): نمونه ها از گزيلول بيرون آورده شدند و به مدت 24ساعت در ظرفهاي پارافين مذاب در دمای 56 درجه سانتي گراد قرار گرفتند. براي آغشتگي بهتر لازم است كه پارافين را عوض كرد. اين عمل به كمك پنس گرم در داخل اون از يك ظرف پارافين به ظرف ديگر انجام گرفت.

4- قالب گيري ( Embedding  ): برای اینکار بافت ها را از داخل پارافين مذاب خارج به داخل پارافینی که داخل قالب قرار داشت وارد نمودیم.  اين عمل بسيار مهم و دقت بسيار زيادي لازم  دارد در اين مطالعه از قالب هاي آلومینيومي استفاده شد روش قالب گيري بدين صورت بود :1-ابتدا پارافين آب شده تازه را در قالب مي ريزيم به طوري كه يك ورقه نازك در كف ظرف درست كند و سفت شود آنگاه بقيه پارافين مذاب را روي آن مي ريزيم 2-بوسيله پنس گرم بافت را به آهستگي در آن قرار داده و سعي مي كنيم كه حبابي در آن باقي نماند .3-سطح برش را به طرف كف ظرف قرار مي دهيم، اگر سطح برش بافت معلوم نيست در اين صورت بايد از سطحي كه احتمال بيشتر مي رود استفاده كرد. اگر چند بافت در زمان واحد قالب گيري مي شود بايد عمل با سرعت انجام گيرد در غير اينصورت پارافين مذاب سفت مي شود .4-بر چسب ياشماره بافت را بايد به دقت در روي بافت قرار داد معمولا بر چسب در سطح مقابل سطح برش قرار مي گيرد.  شماره آن بايد به طرف خارج و قابل خواندن باشد. 5-قالب ها را روي سطح آب –يخ قرار داده تا از ايجاد حباب جلوگيري شود و پارافين خيلي زود سرد شود. بعد به مدت 24 ساعت آن را در فريزرگذاشته تا پارافين خيلي خوب منجمد شود و تهيه برش از آن آسان گردد.6-وقتي كه پارافين خوب سفت و سخت شد آن را از ظرف جدا كرده و به صورت قالب هاي ذوزنقه اي كوچك در آورده شدند.

برش گيري ( Sectioning  ) و ثابت كردن برش ها روي لام

براي برش گيري از دستگاه ميكروتوم دوار(Rotary micro tome ) ساخت شركت (SLEE)استفاده شد.ضخامت برش ها 7 ميكرون انتخاب شده سپس برش گيري صورت گرفت و برش ها بطور مقاطع متوالي ( Serial section ) تهيه شدند.  برش ها متعاقباً بر روي آب 50- 48 که داخل يك ظرف سياه رنگ قرار داشت شناور شدند (در زمينه سياه، چروك بافت به آساني ديده مي شود) تا انبساط و باز شدگي لازم را مجددا بدست آورده وسطح برش ها صاف و يكنواخت گردد.  برش ها سپس بروي يك لام كه با چسب آلبومین آغشته شده بود منتقل شدند.برش ها طوري روي لام قرار گرفتند كه از سمت چپ برش ها از لبه لام 2 سانتيمتر فاصله داشتند واز این فاصله برای حک کردن برچسب و یا شماره لام استفاده گردید.  سپس لام ها بر روي صفحه گرم Hot plate)) خشك گرديدند.  برش ها در اين حالت كاملا به لام چسبیده و ثابت می شوند.

رنگ آميزي (Staining):

 در اين مطالعه براي رنگ آميزي بافتها از روش رنگ آميزي معمولي به روش هماتوكسيلين –ائوزين  (Hematoxylin –Eosin)استفاده شد.

طرز تهيه رنگ

براي تهيه رنگ هماتوكسيلين به روش هاريس 5 گرم پودر هماتوكسيلين، الكل مطلق 100ميلي ليتر، آلوم پتاسيم 10 گرم، آب مقطر 100 میلی لیتر، اكسيدمركوريك 3 گرم، اسيد استيك گلاسيال 20 تا 40 میلی لیتر استفاده گرديد هماتوكسيلين را در الكل مطلق و آلوم را در آب حل كرده و بعد دو محلول مخلوط شدند ،مخلوط را حرارت داده تا به نقطه جوش برسد بعد اكسيدمركوريك را اضافه كرده خيلي سريع آن را سرد كرديم (ظرف محتوي محلول را در داخل ظرف آب سرد گذاشته )بعد اسيد استيك اضافه شده و محلول حاصله صاف شد.  براي افتراق رنگ در روش هماتوكليسين از ائوزين استفاده مي شود. محلول يك درصد الكلي ائوزين ذخيره (استوک) محتوي يك گرم ائوزين واي (Eosin Y) حل شده در 20ميلي ليتر آب مقطر بود.  در مرحله بعد 80 ميلي ليتر الكل اتيليك95% به آن افزوده شد.  از محلول حاصله بعنوان رنگ ائوزین ذخیره استفاده گردید..

هنگام استفاده يك قسمت از محلول ذخيره را با 3 قسمت اتانول80 مخلوط کرده به ازاي100 ميلي ليتر محلول ذخيره 5 ميلي ليتر اسيد اسيتيك به آن افزودیم از محلول حاصله بعنوان محلول کاری ائوزین استفاده گردید. 

روش رنگ آميزي هماتوكليسين- ائوزين:

در نتیجه این نوع رنگ آميزي هسته سلولها رنگ آبي و سيتو پلاسم رنگ صورتي به خود مي گيرد رشته هاي همبند  نيز بر حسب نوع به رنگ صورتي كمرنگ تا پر رنگ در مي آيند . در اين مطالعه از روش رنگ آميزي رگرسيو(regressive) استفاده شده است.

در رنگ آميزي رگرسيو بافت را در محلول هماتوكليسين خنثي رنگ آميزي كرده سپس آنرا براي مدت 15 تا 30 ثانيه در محلول اسيد الكل ( شامل 1000 ميلي ليتر اتانول 70% همراه با 10 ميلي ليتر اسيد كلريدريك غليظ) قرار مي دهند تا كمي از رنگ آن گرفته شود. و بلا فاصله با آب آنرا شستشو مي دهند. اصول كار در اين رنگ آميزي بدين ترتيب است كه قبل از رنگ آميزي بايد پارافين همراه نمونه توسط گزيلول از بين برود. پس از آن بايد بافت بوسيله اتانول آب دهی شود و آنگاه رنگ آميزي انجام پذيرد. بعد از رنگ آميزي لازم است مجددا" بافت توسط اتانول آب گيري گردد سپس الكل توسط گزيلول خارج شود تا نمونه شفاف شده و سر انجام بوسيله چسپ ولامل روي نمونه پوشانده شود. جزئيات مراحل فوق از اين قرارند كه به منظور پارافين گيري (Dewaxing) نمونه دوبار و هر بار به مدت 5 دقيقه در داخل گزيلول قرار داده شده تا پارافين كاملا" حل شده و از روی لام برداشته شود. سپس به منظور آب دهي  (Rehydration) نمونه ها از گزيلول خارج شده و به مدت 5 دقيقه در اتانول مطلق قرار گرفت. سپس اين عمل سه بار با اتانول 96%تكرار شد.(گاهي يك ظرف الكل 95 درجه ،يك ظرف الكل 80 درجه و يك ظرف 70 درجه بكار مي رود ) نمونه ها سپس از الکل خارج و در ظرف حاوی آب مقطر شستشو داده شدند.

رنگ آميزي (staining) از طريق قرار دادن نمونه ها به مدت 5 تا 10 دقيقه در هماتوكسيلین انجام گرفت. پس از آن لام ها در آب جاري شستشو داده شدند . سپس به منظور تفكيك (Differentiation) و كاهش رنگ نمونه ها به مدت 15 تا 30  ثانيه در محلول اسيد الكل قرار داده شدند.  و بلافاصله در آب شستشو داده شد، تا رنگ اضافي برداشته شود. در مرحله بعد آنها به مدت 15 تا 30 ثانيه وارد كربنات ليتيوم گرديد، و بي درنگ در آب شستشو داده شدند.  بعد از این مرحله اطراف هر يك از نمونه ها با دقت بوسیله پنبه تميز گرديد. رنگ آميزي مخالف(counter stain) نيز از طريق قرار گيري لام ها به مدت 5 دقيقه در داخل محلول ائوزين صورت گرفت تا بافت رنگ مخالف را به خود بگيرد. سپس شستشو در آب انجام گرفت.

مرحله بعد شامل آب گيري (Dehydration)مي باشد.  براي اين كار نمونه ها برای دو بار و در هر بار به مدت 5 دقيقه در اتانول 96%قرار گرفته و سر انجام برای دو بار دیگر به مدت 5 دقیقه در اتانول مطلق پاساژ داده شدند.

پس از آب گيري نمونه ها در سه بار متوالي و هر بار به مدت 5 دقيقه از ظرفهاي گزيلول عبور داده شدند تا كاملا" آب و الكل آنها گرفته شود و شفاف گردند.

چسپانيدنmounting))

هر يك از لامها به ترتيب از گريلول خارج شده و بر روي هر كدام از آنها در محل وجود نمونه بافتي يك قطره چسپ كانادا بالزا  قرار گرفت.  سپس يك لامل روي نمونه گذاشته شد.  نمونه تهيه شده به حالت افقي در انكوباتور 37 درجه سانتيگراد نگهداري گرديد تا كاملا" خشك شود.

 

4-2-5: روش هاي آماري

بـرای مـطالعات مورفومتریک به كـمك لـوپ و كـوليـس ديـجتيالي طـول و ارتـفاع بـيضه را بـدست آورده و بر اسـاس فـرمول  V=4/3 π a²b  حـجم بـيضه را بدسـت می آوریم.V  : حجم بـيضه  : aنـصف ارتـفاع و  : bنصف طول بـيضه  (e.g., Torki 2006).

براي بررسي فرآیند اسپرماتوژنز، برشهای گرفته شده را جهت مطالعات كمي و كيفي در زیر میکروسکوپ مطالعه مینماییم. برای این منظور همچون دیگر مطالعات (e.g Torki 2006) تعدادی صفت که میتوان از طریق آنها به بررسی اسپرماتوژنز پرداخت مورد بررسی قرار میدهیم. این صفات به شرح زیر میباشند: .

الف- مطالعات كمي، شامل دو صفت به شرح زیر :

1- صفات اندازه گيري شده شامل شعاع لايه زاينده (GS) و قطر لومن سمنيفروس (LS) مي باشد (واحد دو صفت در طول اين بررسي ميكرومتر است). كه از هر برش حدود 10 عدد لوله سمنيفروس را انتخاب و با استفاده از گراتيكول مدرجي كه بروي عدسي چشمي نصب مي شد شعاع لايه زاينده و قطر لومن سمنيفروس ها را اندازه گيري نموديم.

2- از ديگر صفات كمي مورد بررسي صفات شمارشي بودند كه شامل تعداد رديف هاي اسپرماتوسيت هاي اوليه (PS) و اسپرماتوسيت هاي ثانويه (SS) بودند كه از هر برش حدود 12 لوله سمنيفروس را انتخاب و صفات مذكور را اندازه گيري نموديم .

ب-مطالعات كيفي : در اين مرحله برشهاي تهيه شده از هر ماه نمونه برداري جهت بررسي وحضور اسپرماتوگوني ها، اسپرماتوسيت هاي اوليه، اسپرماتوسيت هاي ثانويه و اسپرماتيدها يا اسپرماتوروئيدها مورد بررسي قرار گرفتند.

آنـاليـز آمـاري : در ايـن بـررسـي از تـست هـاي آمـار تـوصيـفي و تـفكيـك تـوابــع مـتعـارف ((Canonical Discriminant Factions: DF استـفـاده گـرديـد (e.g., Torki 2006).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4-3: نتايج                                                Results

 

4-3-1: زمستانخوابی

بر اساس مشاهدات صورت گرفته در طبیعت میتوان نمونه های گونه مورد مطالعه را  از اواخر زمستان در طبیعت مشاهده نمود. در ماه بهمن به دلیل مساعد نبودن شرایط محیطی از جمله پوشیده بودن زمین از برف  نمیتوان نمونه ای را در طبیعت مشاهده نمود. اما در اواسط اسفند با مسائد شدن هوا و آّب شدن برف ها نمونه های زیادی را میتوان در طبیعت مشاهده نمود. در اوایل بهار بر تراکم جمعیتی نمونه ها افزوده میشود. نمونه ها در طول بهار و تابستان به فعالیت زیستی خود میپردازند. اما رفته رفته به طرف پاییز از تراکم جمعیتی نمونه ها کاسته خواهد شد تا اینکه در اواخر مهر دیگر نمونه های بالغ در طبیعت به ندرت دیده میشود یا اینکه در برخی سالها نمیتوان مشاهده نمود. بر اساس اين مشاهدات که نتیجه عملیات های فراوان طبیعی در طبیعت میباشد میتوان طول دوره زمستانخوابی در این گونه را از اواسط پاییز تا اواخر زمستان فرض نمود. در پایيز و زمستان به دلیل نامسائد بودن شرایط محیطی این گونه به خواب زمستانی کامل فرو میرود. نمایی از زمستان در شکل 4-3-1 نشان داده شده است. همانطور که مشاهده میشود بدیهی است که در این فصل گونه نمیتواند فعالیت زیستی داشته باشد چرا که محیط طبیعی به خواب رفته است.

 

 

4-3-2: سیستم جنسی

هنگامی که نمونه ها را تشریح میکنیم سیستم جنسی را میتوان در پشت سیستم گوارشی چسبیده به سطح پشتی جانور مشاهده نمود. پس از زمستانخوابی میتوان به راحتی سیستم جنسی را مشاهده نمود اما پیش از زمستانخوابی این موضوع مشکل میباشد و بایستی با دقت کامل این کار را انجام داد. دلیل این امر را میتوان در حجم سیستم جنسی در پیش و پس از زمستانخوابی پیدا نمود که در زیر بیشتر مورد بررسی قرار مییرد.

 

4-3-2-1: سیستم جنسی نر

سيستم جفت گيري نر (شکل 4-3-2) شامل يك جفت بيضه سفيد رنگ و بيضوي شكل، يك جفت اسپرميداكت و يك جفت همي پنيس. بیضه سمت راست بالاتر از بیضه سمت چپ قرار گرفته است.  بر اساس مشاهدات صورت گرفته پس از زمستانخوابی بیضه ها حالتی چین دار و اسپرمیداکت حالتی زیکزاکی دارد.  این حالت در تمام نمونه های بالغ دیده میشود. حجم بیضه در این زمان بالاترین را دارد و به طور میانگین برابر است با(*0.1mm³)   ± .

 

 اما در نمونه هایی که قبل از زمستانخوابی جمع آوری شده اند حالت ظاهری بیضه ها و اسپرمیداکت ها صاف میباشد و حالت چین دار یا زیکزاکی ندارند. از طرفی دیگر حجم بیضه ها و اسپرمیداکت پس از زمستانخوابی زیاد میباشد و پیش از زمستانخوابی پایین می آید. در این زمان (پیش از زمستانخوابی) حجم بیضه به کمترین حد خود در حدود(*0.1mm³)    میرشد

هر بيضه به طور جداگانه، به وسيله اسپرميداكت به زير ناحيه كلواك ادامه پيدا مي كند. در نهايت هر بيضه به يك همي پنيس متصل مي شود. همی پنیس با مجرای ادراری در ارتباط نیست و تنها اندامی برای تولید مثل می باشد. در هنگام لقاح همی پنیس وارد مجرای کلواکی فرد ماده می شود. همي پنيس رنگ آن سفيد مات، ستبر و انتهاي آن در حالت راست کرده به صرت غنچه ای میباشد. همي پنيس نيز مانند بيضه در طول فعاليت زيستي تغييراتي را نشان می دهد. همي پنيس ها را در اوايل بهار، براحتي مي توان بيرون آورد در حاليكه در اواخر تابستان انجام اين امر دشوار مي باشد .

 

4-3-2-2: سیستم جنسی ماده

سيستم جفت گيري ماده متشكل از يك جفت تخمدان، يك جفت اويداكت مي باشد. از لحاظ موقعيتي تخمدان ها پايين‌‌‌‌تر از ششها و در طرفين ستون مهره‌‌‌‌ها قرار می گیرند و در اواسط بهار داراي تعداد زيادي تخم مي باشند. در ادامه تخمدان مي توان اويداكت ها را مشاهده نماييم. در انتهاي اويداكت كلواك قرار دارد . هر كدام از اويداكت ها به طور جداگانه به كلواك متصل شده اند. در نمونه هاي ماده تشريح شده در فصل بهار، تعداد 4 الی 6 تخم در هر تخمدان مشاهده شده است (شکل 4-3-3). یعنی در هر نمونه ماده که میتواند تولید مثل کند بین 8 الی 12 تخم را در زمان فعال تولید مثلی میتوان مشاهده نمود.  علاوه بر تخم هاي بزرگ مي توان فوليكولهاي فراواني را در تخمدان مشاهده نماييم. اما در نمونه هاي ماده تشريح شده در اواخر فصل تابستان، تخم هاي بزرگ مشاهده نشد، فوليكولها با چشم غير مسلح به سختي قابل مشاهده مي باشند، براي مشاهده بهتر فاصله از استريوميكرسكوپ استفاده گرديد (شکل 4-3-3).

 

 

4-3-3: بررسی بافت شناسی

در بررسی بافت شناسی سیستم جنسی، دو جنس نر و ماده را به طور جداگانه مورد بررسی قرار میدهیم.

 

4-3-3-1:  سیستم جنسی نر

برش های بافتی نشان داد که بیضه از سمنیفروس های بسیار زیادی تسکیل شده است. در زیر میکروسکوپ هر سمنیفروس به صورت لوله ای جداگانه میباشد که برش عرضی خورده است. سمنیفروس ها در کنار همدیگر به صورت دایره ای، بیضی و بینابین دیده میشوند. لایه ای از بافت همبند اطراف کل سمنیفروس ها را پوشاند. بین سمنیفروس ها سلول های در فضای زمینه وجود دارد. بیشتر این سلول ها از نوع فیبروسیت میباشند. بر اساس مقاطع بافتی تهیه شده سمنیفروس ها و اسپرمیداکت در طول فعلیت زیستی تفاوتهایی را نشان داده. در زیر به بررسی تفاوت های مشاهده شده در مقاطع تهیه شده میپردازیم.

در تمامی مقاطع بافتی تهیه شده در دوره پس ا ز زمستانخوابی (شکل 4-3-4) میتوان اسپرماتوگونی ها، اسپرماتوسیت های اولیه و ثانویه را مشاهده نماییم. علاوه بر این سلول ها اسپرم ها را به صورت شناور در داخل لومن سمنیفروس میتوان مشاهده کرد.

 

این در حالی است که در دوره پیش از زمستانخوابی اسپرماتوسیتی در لایه ژرمینال نمیتوان مشاهده نمود و همچنین اسپرمی را در داخل لومن سمنیفروس نمیتوان مشاهده نمود. از طرفی دیگر برش های تهیه شده از اسپرمیداکت نشان داد که در دوره پس از زمستانخوابی درون اسپرمیداکت پر از اسپرم است اما در دوره پیش از زمستانخوابی لومن اسپرمیداکت خالی از هر گونه اسپرم است (شکل 4-3-5). بنابراین بر اساس مطالعات کیفی بافتی میتوان نتیجه گرفت که در دوره پس از زمستانخوابی اسپرماتوژنز فعال میباشد ولی در دوره پیش از زمستانخوابی اسپرماتوژنز غیر فعال میباشد. بررسی های بیشتر در مورد بقیه ماه های سال یعنی بین دو دوره پس از زمستانخوابی و پیش از زمستانخوابی نشان داد، هر چه به طرف زمستانخوابی پیش میرویم از فعالیت اسپرماتوژنزی کاسته شده تا اینکه در پیش از زمستانخوابی اسپرماتوژنز کاملا متوقف میگردد.

 

 

4-3-3-2: سیستم جنسی ماده

مطالعات بافت شناسی روی اویداکت هماننتد بیضه در طول فعالیت زیستی صورت گرفته. نتایج بررسی های کیفی نشان داد که تخمدان در زمان بهار و اوایل تابستان دارای غده هایی است که این غده ها پیش از زمستانخوابی وجود ندارند (شکل 4-3-6). غده های گفته شده برای تشکیل پوسته تخم ضروری میباشند. از طرفی دیگر به دلیل غیر فعال شدن غده های ذکر شده، ضخامت لایه اویداکت کاهش یافته (شکل 4-3-6). بر این اساس میتوان گفت که فعالیت تخمدان زمانی میباشد که اویداکت دارای غده است و ضخامت آن نیز بالا میباشد این حالت در بهار و اوایل تابستان  دیده میشود. اما پیش از زمستانخوابی این حالت مشاهده نمیشود. بنابراین پیش از زمستانخوابی تخمدان و اویداکت از نظر فعالیت های تولید مثلی خاموش میباشند.

 

 

4-3-4: بررسی آماری

در این مبحث سعی شده از گراف های زیادی استفاده نماییم تا موضوع برای خواننده قابل درک باشد. از طرفی دیگر برای آنالیز داده ها از تست های آماری معتبر استفاده شده است. بررسی آماری را برای جنس نر و ماده به طور جداگانه به شرح زیر توضیح میدهیم.

 

4-3-4-1: سیکل بیضه ای و اسپرماتوژنز

تمامی صفات مورد بررسی پس از زمستانخوابی تا پیش از زمستانخوابی سیری نزولی دارند (شکل 4-3-7). بالاترین سطح مربوط به اواخر زمستان و اوایل بهار میباشد و پایینترین سطح هر کدام از صفات مربوط به اواخر تابستان و اوایل پاییز میباشد.

 

 

از طرفی دیگر تمامی صفات با همدیگر رابطه ای مشخص دارند، بغیر از رابطه بین اندازه بدن با بقیه صفات. برای مثال اندازه بدن با حجحم بیضه رابطه مشخص و معناداری ندارد (شکل ...) اما حجم بیضه با قطر لومن اسپرمیداکت رابطه ای مشخص و معنادار دارد. رابطه صفات باهمدیگر نشان دهنده این است که صفات از اوایل پس از زمستانخوابی تا پیش از زمستانخوابی به طور تقریبا یکسان کاهش میابند.

 

 

تغييرات GS, LE, TV در طي مسير دژنراسيون رابطه معناداری دارد (P< 0.05, R-square> 0.98) و ضريب همبستگي پيرسون آن بالاي  ولي معكوس ميباشد (بالاي 90%-) كه نشان دهنده كاهش مقدار كمي سه صفت از ابتداي فاز تا انتهاي فاز است. اما براي دو فاكتور SVL, LS رابطه معنادار نميباشد (P> )  و ضريب همبستگي پيرسون آن نيز بسيار كم ميباشد(0.04-) كه نشان دهنده تغيير نكردن اندازه نمونه هاي گرفته شده در طول فاز ميباشد. دليل اين امر نمونه برداري از افراد بالغ ميباشد(Mean SVL=  mm) (شکل 4-3-8). براي صفات GS, LE, TV كه رابطه معنادار با مسير دژنراسيون دارند، DFA را اجرا نموده . نتيجه آناليز نشان دهنده جدا شدن فازها از همديگر بر اساس ماه هاي سال ميباشد (شکل 4-3-9) .

 

 

 با ادغام نتايج آماري و كيفي بافتي میتوانیم سه فاز اسپرماتوژنز را در گونه Ophisops elegans در فلات غربي ايران، زاگرس مركزي به شرح زیر ارائه داد:

(1) فاز فعال در ماه هاي   كه اسپرماتوژنز در آن اتفاق افتاده و ميتوان اسپرماتوسيتها ي اوليه و ثانويه و همچنين اسپرماتوزوئيدها را در لومن سمنيفروس يا لومن اپيديديم مشاهده نمود. (2) فاز استراحت، در اين فاز اسپرماتوسيتها و اسپرماتوزوئيدها را نميتوان مشاهده نمود و فاز (3) فاز انتقالي، در اين فاز برخی نمونه ها واجد اسپرماتوزوئيد و اسپرماتوسيت در سمنيفروس اند اما برخی دیگر فاقد اسپرماتوزوئيد و اسپرماتوسيت در سمنیفروس اند. بنابراين در دوره دژنراسيون كه حدود 7 ماه طول ميكشد، سه فاز جداگانه در سيكل بيضه اي يا اسپرماتوژنز ميتوان مشاهده نمود. فاز فعال از اواخر زمستان تا اواخر بهار رخ داده، فاز انتقالی از اواخر بهار تا اواسط تابستان و فاز غیر فعال یا خاموش از اواخر تابستان تا اوایل پایز رخ میدهد.

 

4-3-4-2: سیکل تخمدانی

برای به دست آوردن رابطه آماری در سیکل تخمدانی از صفات بافت شناسی استفاده کرده. بنابراین برای این منظور از صفاتی همچون تراکم غده های قابل تشخیص در دیواره تخمدان، ضخامت دیواره تخمدان و ضخامت ظاهری تخمدان استفاده نموده. نتیجه را به صورت آنالیز DF اجرا نموده.  همانطوریکه در شکل 4-3-10 مشاهده میشود ماه های اواخر تابستان تا اوایل پایز از بقیه سال جدا شده است.

 

 

به دلیلی اینکه در دوره پیش از زمستانخوابی تخمدان از نظر بافتی حالت خاموش را به خود گرفته این دوره را فاز خاموش مینامییم و بقیه زمان فعالیت زیستی را فاز فعال تخمدانی مینامیم (شکل 4-3-10).

 

4-3-5: تخمگذاری و رشد

بر اسا مشاهدات صورت گرفته در طبیعت نمونه های جوان را میتوان از اواسط تابستان تا زمان پیش از زمستانخوابی مشاهده نمود. با توجه به فازهای به دست آمده در جنس نر و ماده میتوان نتیجه گرفت که در فصل بهار آمیزش جنسی و لقاح صورت گرفته سپس تخم ها در اواخر بهار و اوایل تابستان در درون جنس ماده رشد کرده (ضخامت و غده های دیواره تخمدان این موضوع را تایید میکند)، و تخمریزی خود را در اواخر بهار یا اوایل تابستان انجام داده سپس پس از مدتی نوزادان از تخم خارج شده در این زمان است که تخمدان از نظر تولید مثل کم کم غیر فعال میگردد و جنس نر نیز در این زمان است که سیستم جنسی آن غیر فعال میگردد.

 

 

 

 

 

 

 

4-4: بحث                                                Discusion

 

4-4-1: زمستانخوابی

گـاهی در زمـستان ارتفاع بـرف در نـاحیه مطالعاتی بـه بیش از 1 (یک) مـتر نیز مـی رسد به طوری که ایـن شرایط سبب تـوقـف فـعالیت زیستی اکثر گـونـه های جـانـوری شده، ایـن توقف فـعالیت های زیـستی خزنـدگـان ایـن نـاحیـه را در بر میگیرد (Torki, 2005b, 2006, 2007). این شرایـط سخت آب وهوایـی باعث زمـستان خـوابی کامـل گونـه های خزنده مي شود (Story et al, 1988 . Costanzo and Claussen 1990 . Grenot et al, 1996, Torki, 2006) حرارت در زمستان مخصوصاً در دی ماه و اوایل بهمن ماه بسیار پایین می باشد و میانگین حداقل درجه حرارت در دی ماه 3.6- و بهمن ماه 4.9- می باشد. بر اساس گزارش هاي ایستگاه سینوپتیک هواشناسی دلفان، حرارت در این نواحی بارها به کمتر از °c21-  نیز رسیده است . این کاهش حرارت مسلماً در ارتفاعات بالاتر که گونه های مورد مطالعه در آن زیست می کنند به پایین تر از این حد نیز می رسد (شکل 4-4-1).

 

 

با شروع فصل بهار برف ها شروع به ذوب شدن نموده و گونه های جانوری از خواب زمستاني بیرون آمده و فعالیت خود را از سر می گیرند . به دلیل کوچک بودن جثه گونه های مورد مطالعه نسبت به دیگر سوسمار ها، زودتر از خواب زمستانی بیدار شده وفعالیت زیستی خود را آغاز می نمایند (ترکی و رستگار-پویانی، 1385).

بر اساس مشاهدات صورت گرفته هنگام بارندگی، نمونه های گونه مورد مطالعه به پناهگاه خود رفته و تا پایان بارندگی (هر چند روز که طول بکشد) از پناهگاه خود خارج نمی گردند . جالب است که این نمونه ها مدتی قبل از بارندگی به پناهگاه خود می روند اما در روزهایی که هوا ابری بوده ولی باران نمی بارد چنین واکنشی در آنها دیده نمی شود . از این رو به نظر می رسد که این سوسماران قدرت تشخیص بارندگی را داشته باشند. این موضوع را می توان به زمان قبل از زمستان خوابی نیز تعمیم داد، به این صورت که، نمونه ها می توانند بارندگی های مؤثر (بارندگی های طولانی که نشانی از بر هم خوردن تعادل حرارتی باشد) را از بارندگی های غیر مؤثر (بارندگی های کوتاه مدت، که نشانی از بر هم خوردن تعادل حرارتی را نداشته و نمونه ها می توانند پس از آن نیز فعالیت طبیعی خود را ادامه دهند ) تشخیص داده وبه خواب زمستانی فرو روند . این مطلب موضوع مهمی می باشد و می توان از نظر رفتارشناسی در مورد آن تحقیق نمود . در این ناحیه هر چه که به طرف تابستان نزدیکتر می شویم حرارت بالاتر رفته و از میزان بارندگی های پراکنده کاسته می شود تا جایی که در تابستان بارندگی ها متوقف شده. در این زمان است که گونه مورد مطالعه حداکثر فعالیت زیستی از خود نشان میدهد. در پایان تابستان   (شهریور ماه) از شدت حرارت کاسته شده و با شروع فصل پائیز این کاهش بارزتر می گردد، در این زمان است که کم کم فعالیت زیستی گونه های سوسمار کاهش می یابد و در نهایت با شروع اعتدال پاییزی و وزش بادهای ملایم (متمایل به سرد) به کمترین میزان ممکن می رسد (به خصوص در اوایل و اواخر روز که دامنه فعالیت زیستی گونه بیشتر تحت تأثیر قرار می گیرد). کاهش درجه حرارت به عنوان یک عامل محدودکننده در فعالیت زیستی گونه به شمار می رود و سیگنالی برای ورود به خواب زمستانی است. در این زمان (فصل پائیز ) که گونه های سوسمار ساکن ارتفاعات ناحیه مطالعاتی به خواب زمستانی فرو میروند. بر اساس مشاهدات صورت گرفته سوسماران این ارتفاعات در اوایل پاییز کمترین فعالیت زیستی از خود نشان می دهند. در کل می توان تأثیرات کلیمایی ناحیه مطالعاتی را در اکولوژی رفتار سوسمار ها که زمینه لازم برای مطالعه سیستم های تولید مثلی و به خصوص اسپرماتوژنز را مهیا نموده و به صورت زیر بیان نمود:  پس از پایان یافتن فصل سرما در اواخر فصل زمستان تراکم جمعیتی گونه ها کم می باشد اما با بالا رفتن حرارت تراکم جمعیتی آنها افزایش می یابد . تا اینکه در فصل بهار به حداکثر تراکم ممکن می رسد. اما این تراکم از اواخر شهریور ماه سیر نزولی در پیش گرفته تا جایی که در مهرماه به کمترین حد خود رسیـده و در اواسط پایـیـز به صفـر می رسـد و در ایـن زمان اسـت که نـمونه ها زمسـتان خوابـی را شـروع میکنند.

مطالعات و مشاهدات تراکم جمعیتی در دوره فعالیت زیستی گونه ها، نشان دهنده این موضوع است که نمونه های جوان زودتر از خواب زمستانی بیرون آمده و دیرتر به خواب زمستانی فرو می روند . سؤالی که در اینجا مطرح می شود این است که دلیل این موضوع چیست ؟ بر اساس مشاهدات صورت گرفتهو مطاعلات بافتی (پایان نامه حاضر) به این دلیل است كه نمونه های جوان در فصل تابستان از تخم خارج شده و تا قبل از زمستان خوابي مدت زمان کمی برای کسب انرژی برای افزایش وزن و حجم خود در اختيار دارند و از طرفی دیگر چون بایستی انرژی بيشتري براي طول دورة زمستان خوابی به دست آورند زمان بیشتری را نسبت به نمونه های بالغ نیاز دارند تا ذخیره چربی خود را به حداکثر ممكن  برسانند. این موضوع باعث می شود که نمونه هاي جوان نسبت به نمونه هاي بالغ ديرتر به خواب زمستانی فرو روند، چرا که نمونه های بالغ یک دوره کامل فعالیت زیستی را گذرانده اما نمونه های جوان دوره فعالیت زیستی را به طور ناقص طي كرده اند . از طرف دیگر چون كسب انرژی برای زمستان خوابی برای نمونه های جوان ناقص انجام شده به ناچار بایستی به محض گرم شدن هوا زودتر از نمونه هاي بالغ برای کسب انرژی و تغذیه بیدار شوند . چرا که نمونه های بالغ ذخیره چربی فراوانی برای خود کسب نموده و تا مساعد شدن هوای محیط از خواب بیدار نمی شوند. میزان ذخیره چربی در نمونه های جوان از نظر زیست گونه و بقاء گونه بسیار حائز اهمیت می باشد چرا که احتمال دارد تعدادی از نمونه ها بر اثر فشار منفی ناشی از کمبود انرژی نتوانند زمستان خوابی را به خوبی بگذرانند و در طول زمستان خوابی برای همیشه به خواب ابدی فرو روند و هرگز از خواب زمستانی بیدار نشوند . وجود اين ذخيره چربي از نظر تولید مثلی نيز بسیار حائز اهمیت می باشد و باعث بقاء گونه مي شود و این موضوع تحت عنوان انتخاب طبیعی معرفی می شود .

 

4-4-2: تولید مثل جنس نر

دلیل چروکیدگی بیضه ها و حالت زیکزاکی اسپرمیداکت فعال بودن سیستم جنسی نر میباشد. زیرا در این زمان در سمنیفروس تولید اسپرم صورت گرفته و برای تولید اسپرم بایستی لایه ژرمینال کامل شده باشد (شامل اسپرماتوسیت ها و اسپرماتوگونی ها) فعالیت بالای اسپرماتوژنز باعث میگردد که بیضه چین دار گردد و اسپرمیداکت حالتی زیکزاکی بگیرد. مطالعات بافت شناسی که در قسمت نتیجه گیری گفته شد این موضوع را اثبات میکند. از طرفی دیگر به دلیل غیر فعال شدن سیستم جنسی نر، بیضه ها و اسپرمیداکت قبل از زمستانخوابی حالتی صاف به خود گرفته. مطالعات بافت شناسی این موضوع را اثبات نمود، چرا که تولید اسپرمی صورت نمیگیرد. حجم بیضه پس از زمستانخوابی تا قبل از زمستانخوابی حدود 90% کاهش را نشان داده. کاهش بالای ظاهری حجم بیضه نیز تکمیل کننده موضوعات قبلی میباشد.

در ابتداي دوره دژنراسون حجم بيضه و قطر لايه زاينده سمنيفروس بالاترين حد خود را داشته ، بنابراين شاهد بالاترين ميزان تعداد رديف اسپرماتوسيت هاي اوليه و ثانويه ميباشيم در نتيجه ميتوان اسپرم ها را در لومن سمنيفروس مشاهده نمود. هر چه از فعاليت تاكسون ها ميگذرد يعني زمان به طرف زمستانخوابي سير ميكند از ميزان قطر لايه زاينده و تعداد رديف هاي اسپرماتوسيت اوليه و ثانويه كاسته ميشود تا اينكه در پايان دوره دژنراسيون اسپرماتوژنز كه فبل از زمستانخوابي تاكسون ها ميباشد قطر لايه زاينده سمنيفروس به كمترين ميزان خود رسيده به طوري كه نميتوان اسپرماتوسيت ها را مشاهده نمود. به دليل سير نزولي اسپرماتوژنز اين مرحله را دوره رژنراسيون يا شيب منفي اسپرماتوژنزميناميم. در ناحيه مطالعاتي به دليل دوره هاي يخبندان زمستانه تاكسون هاي سوسمار به خواب زمستاني فرو رفته (e.g., Torki 2006).  در طي زمستانخوابي بايستي شيب منفي اسپرماتوژنز جبران گردد. با شروع زمستانخوابي شاهد كمترين ميزان قطر لايه زاينده ميباشم ، اين كمترين ميزان تا پايان زمستانخوابي بايستي به بالاترين ميزان خود برسد تا اينكه با شروع مجدد فعاليت تاكسونها در طبيعت (پس از پايان زمستانخوابي) فعاليت اسپرماتوژنز و در نتيجه لقاح موقيت آميز صورت گيرد تا تاكسون بتواند از انقراض نسل خود جلوگيري كند و توليد نسل تاكسون ادامه يابد. با شروع دوره زمستانخوابي رژنراسيون اسپرماتوژنز شروع ميشود. بنابراين ميتوان دوره رژنراسيون را شيب مثبت اسپرماتوژنز ناميد. چرا كه در اين دوره ميتوان رشد صعودي سمنيفروس را از ابتدا تا انتها مشاهده نمود. اما دوره دژنراسيون را ميتوان شيب منفي اسپرماتوژنز ناميد چرا كه در طي اين دوره اسپرماتوژنز افول ميبابد و رشد كاهشي سمنيفروس را به دنبال دارد.  

 

4-4-3: زمستانخوابي و اسپرماتوژنز

در شرايط كليمايي معتدل به دليل سخت شدن شرايط زيست، فعاليت تاكسون ها  از نظر رفتاري متوقف شده و تاكسون به ركود زمستاني ميرود (Costanzo and Lee 1995; Torki 2006).  زمستانخوابي براي تاكسون هاي موجود در چنين شرايط سخت كليمايي بسيار مهم ميباشد چون عناصر اكوسيتم و زنجيره غذايي درطول زمستانخوابي قطع شده و منابع غذايي تاكسون ها عملا ناپديد ميگردند، پس تاكسون بايستي در طي زمستان كمترين ميزان انرژي را از دست دهد تا بتواند پس از گذشت شرايط سخت دوباره به طبيعت بازگردد و فعاليت زيستي خود را آغاز نمايد (Storey et al 1988; Ultsch1 989;  Somme 1995; Grenot et al 1996). از اين نظر زمستانخوابي را ميتوان به عنوان نتيجه تكاملي سازش با محيط در تاكسون هاي زمستانخواب براي بقاء نسل در مسير تكامل و از دست ندادن انرژي، بسيار مهم تلقي نمود(Agid et al. 1961; Duguy 1963; Storey and Storey 1985; Costanzo 1985) . تاكسون هاي زمستانخواب براي گذاراندن زمستانخوابي ذخيره چربي را در خود جمع كرده، چون تاكسون براي تغذيه نميتواند از پناهگاه زمستانه خود خارج گردد و اصولا ديگر غذايي در طبيعت وجود ندارد كه بتواند از آن استفاده كند و تنها منبع تغذيه تاكسون در طي زمستان مقدار ذخيره چربي ميباشد كه قبل از زمستانخوابي آن را جمع آوري نموده ميباشد (Torki 2005a, 2006). شيب مثبت اسپرماتوژنز در دوره زمستانخوابي اتفاق افتاده، بنابراين رژنزاسيون اسپرماتوژنز در شرايط كليمايي معتدل كه تاكسون داراي زمستانخوابي است، تنها به وسيله ميزان ذخيره چربي ممكن ميباشد. همچنين زمستانخوابي را ميتوان به عنوان عامل مهم و طبيعي مرگ تاكسون هاي زمستان خواب تلقي نمود، چرا كه (1) جوان هايي كه تازه از تخم بيرون آمده و مي خواهند اولين سال زندگي را بگذرانند با كمبود ذخيره چربي روبرو شده و ميزان بالايي از جمعيت ممكن است به اين دليل بميرند، (2)  همچنين نمونه هاي پير به دليل اندازه بزرگ خود و نداشتن ذخيره چربي براي هميشه به خواب زمستاني فرو ميروند، در هر دو حالت لاشه جانور در پناهگاه زمستانه باقي مانده، به اين دو دليل لاشه كمتر جانور زمستان خواب را ميتوان در طبيعت مشاهده نمود مگر اينكه به دست صياد شكار شده باشد. بنابراين زمستانخوابي از طريق رژنراسيون اسپرماتوژنز باعث ابقاء نسل و از طرفي ديگر باعث مرگ تاكسون ها ميگردند.

 

 

 

   

*****************************

بر اساس نتایج و مباحث گفته شده نتیجه نهای مبحث تولید مثل در Ophiops elegans در زاگرس مرکزی در شرایط آب و هوایی معتدل سرد به شرح زیر خلاصه میگردد:

مد تولید مثلی تخم گذار است، سیکل تولید مثل قصلی میباشد و از نوع associated است. دوره دژنراسیون به سه فاز فعال، انتقالی و غیر فعال تقسیم میشود. زمان فعال تولید مثل جنس نر بهار و زمان فعال جنسی ماده بهار تا اواسط تابستان میباشد.

© 2006-2013. All photos/graphics/text remain the copyright of FTEHCR